Окрашивание липидов и липоидов (Судан III)

Окрашивание жира и липоидов очень часто применяется в гистологической и патологоанатомической практике. Различные методики окраски позволяют не только обнаружить жиры и жироподобные вещества в клетках и тканях, но и судить о характере этих веществ.

Часто употребляют для этой цели судан III, IV, шарлах красный, нильблаусульфат и осмиевую кислоту.

Мы рассмотрим лишь окраску суданом III и красным шарлахом — как наиболее часто применяемые. Указанные красители выявляют все жиры и липоиды, нейтральные жиры интенсивно окрашиваются в оранжево-красный цвет.

Для выявления жиров требуется формалиновая фиксация; фиксировать нужно не более 48 часов. После промывки кусочки режут на замораживающем микротоме. Обычные методы заливки применять нельзя, так как эфир, ксилол и крепкие спирты, употребляемые при заливке, растворяют и извлекают жиры из изучаемых объектов.

Метод окраски суданом III и красным шарлахом основан на том, что эти краски хорошо растворяются в жирах. Из насыщенных спиртовых растворов судан III и шарлах красный легко переходят в жир окрашиваемых тканей. Растворимость судана III и шарлаха красного в жирах гораздо выше, чем в спирте.

 

Окрашивание суданом III (О.В.Волкова, Ю.К.Елецкий, 1982). Является наиболее распространенным методом выявления жира.

Приготовление раствора красителя. В 100 мл горячего 70% спирта засыпают 0,2-0,3 г порошка судана III, несколько раз взбалтывают и ставят в термостат (при 58°С) на несколько часов, затем охлаждают и фильтруют.

Метод.

1. Замороженные срезы (из свежей или фиксированной в формалине ткани) на несколько минут переносят из воды в 50% спирт.

2. Помещают в спиртовой раствор красителя на 15-30 мин (при применении щелочного раствора судана III — на 5 минут).

3. Быстро ополаскивают в 50% спирте.

4. Промывают в дистиллированной воде.

5. Подкрашивают ядра кислым гемалауном или гематоксилином Эрлиха.

6. Промывают и заключают в желатин или глицерин-желатин

Результат: жировые вещества интенсивно оранжево-красного цвета, ядра — синие.

 

Окраску срезов раствором Судана III следует проводить в бюксе с закрытой крышкой. В противном случае спирт испаряется, и из насыщенного раствора судан III выпадает в виде осадка, который остается в препарате.

 

Шарлах красный для окраски жира употребляют точно в той же прописи и вполне аналогичным способом, что и судан III.

 

Окраска шарлахом красным (О.В.Волкова, Ю.К.Елецкий, 1982).

Красители: в смесь из 50мл ацетона и 50 мл 70% спирта засыпают 0,2-0,3 г шарлаха. Хорошо закрывают и взбалтывают. Полученный раствор перед употреблением фильтруют.

Метод.

1. Замороженные срезы из свежей или фиксированной в формалине ткани помещают в 50% спирт на 2-4 мин.

2. Окрашивают в растворе красителя 2-3 мин.

3.  Быстро ополаскивают в 70% спирте.

4. Промывают в воде.

5. Подкрашивают ядра кислым гемалауном или гематоксилином Эрлиха.

6. Промывают в воде и заключают в глицерин или глицерин-желатин.

Результат. Жировые вещества оранжево-красные, ядра — синие.

 

Окраска жира Суданом III и шарлахом красным довольно быстро выцветает, поэтому желательно исследовать препараты вскоре после их изготовления. Окрашенные на жир срезы нельзя обезвоживать и заключать обычным способом: это вызвало бы растворение и извлечение жира из препарата (ксилол, в котором растворяют бальзам, растворит и жиры). Учитывая сказанное, срезы после окраски на жирзаключают в глицерин или глицерин-желатин, которые не растворяют жира и хорошо просветляют необезвоженный препарат. Жидкий глицерин не дает возможности фиксировать покровное стекло над препаратом. Для укрепления покровного стекла его по краям покрывают валиком из расплавленного парафина, а лучше из менделеевской замазки. Чтобы добиться хорошего прикрепления покровного стекла, надо, заключая препарат, наносить на него такое количество глицерина, которое не достигало бы краев покровного стекла. После заключения в глицерин-желатин при длительном хранении препаратов наблюдается выпадение судана III в виде красных кристаллов.

 

Результаты окраски срезов головного мозга, миокарда, лёгкого, почки суданом III.

 

Рис. 1, 2. Липидные включения цитоплазмы клеток коры надпочечника в виде большого количества оранжево-красный округлых включений. Контроль красителя.

Окраска: судан III. Увеличение х100 и х250.

Рис. 3, 4. Обтурирующие жировые эмболы в капиллярах ствола головного мозга в виде колбасовидных однородных оранжево-жёлтых включений.

Окраска: судан III. Увеличение х250.

Рис. 5-8. Выраженная жировая эмболия лёгких. Просветы большого количества капилляров межальвеолярных перегородок, артерий и вен обтурированы оранжево-жёлтыми жировыми эмболами. Сопутствует явление жирового эмболизма (в ряде капилляров мелкие жировые капли оранжево-жёлтого цвета, размерами менее 8 мкм).

Окраска: судан III. Увеличение х100.

Рис. 9, 10. Выраженное явление жирового эмболизма (просветы большинства межальвеолярных капилляров с наличием гомогенных жировых капель оранжево-жёлтого цвета, размерами менее 8 мкм). Окраска: судан III. Увеличение х250.

Рис. 11. В просвете сосуда на фоне лейкостаза группа округло-овальных оптических пустот различной величины, похожих на жировые эмболы.

Окраска: гематоксилин-эозин.

Увеличение х250.

Рис. 12. Включения округлых оранжево-красных жировых капель в толще внутрипросветных смешанных тромбов на фоне отсутствия крови в просветах сосудов.

Окраска: судан III. Увеличение х250.

Рис. 13. Просветы отдельных сосудов растянуты округлыми оптическими пустотами, похожими на жировые эмболы.

Окраска: гематоксилин-эозин.

Увеличение х250.

Рис. 14. Тканевая эмболия (в просвете сосуда фрагмент костного мозга). Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х400. Препарат представлен кафедрой СМ Ижевской ГМА.

Рис. 15. Просветы отдельных капиллярных петель почечных клубочков растянуты округло-овальными оптическими пустотами, похожими на жировые эмболы. Окраска: гематоксилин-эозин.

Увеличение х250.

Рис. 16. Отдельные капиллярные петли почечных канальцев обтурированы червеобразными гомогенными оранжево-жёлтыми жировыми эмболами.

Окраска: судан III. Увеличение х250.

Рис. 17, 18. Жировая дистрофия эпителия ряда почечных канальцев. В цитоплазме эпителиоцитов канальцев мелкие оранжево-красные включения. Труп женщины, 67 лет, страдавшей сахарным диабетом I типа, с тяжёлым его течением.

Окраска: судан III. Увеличение х250.

 

Рис. 19-22. Диффузно в срезах на синем фоне расположены небольшие, средней величины и крупные группы набухших кардиомиоцитов с потерей поперечной исчерченности, пикнотичными или лизированными ядрами, в их цитоплазме очень мелкие (пылевидное ожирение), мелкие (мелкокапельное ожирение) и крупные (крупнокапельное ожирение) жировые капли оранжево-жёлтого цвета, на отдельных участках срезов полностью замещающие цитоплазму кардиомиоцитов.

Окраска: судан III. Увеличение х250 их400.

 

Для сравнения приведём картину срезов миокарда от этого же трупа (женщина, 27 лет, страдавшая хроническим алкоголизмом, наркоманией, ВИЧ-инфицированной) при окраске гематоксилином-эозином:

 

Рис. 23, 24. Группы набухших кардиомиоцитов с потерей поперечной исчерченности, пикнотичными или лизированными ядрами, в их цитоплазме очень мелкие, мелкие и крупные округло-овальные включения, оптические пустоты, похожие на жировые капли, на отдельных участках срезов полностью замещающие цитоплазму кардиомиоцитов. Сохранившиеся кардиомиоциты в состоянии слабой-умеренной гипертрофии. Единичные мелкие очаги лейкоцитарной инфильтрации стромы.

Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х250.

 

При гистологическом исследовании ткани легких в зависимости от количества выявляемых жировых эмболов (в 10 полях зрения, увеличение х56, окуляр х7, объектив х8) и уровня их распространения в сосудах легких В.И. Адкин (1976) выделяет несколько степеней жировой эмболии малого круга кровообращения:

  • очень слабая — до 5-10 жировых эмболов в капиллярах межальвеолярных перегородок и очень редко — в мелких артериях;
  • слабаяот 11 до 30 эмболов в капиллярах, реже — в артериолах и мелких артериях;
  • умереннаяот 31 до 100 жировых эмболов в капиллярах, артериолах и артериях среднего калибра;
  • сильнаяот 101 до 200 эмболов в просветах артерий, вен и капилляров;
  • очень сильнаяболее 200 жировых эмболов в различных сосудах легких.

 

По В.И. Адкину (1976), выраженность жировой эмболии большого круга кровообращения также оценивается по количеству жировых эмболов в 10 полях зрения при увеличении х56:

для головного мозга, сердца и печени: слабая степень жировой эмболии при обнаружении от 1-5 до 15-25 жировых эмболов; сильная — более 25 эмболов;

 

почки: слабая степень жировой эмболии — в срезе обнаруживаются единичные (до 5) клубочки, капилляры которых заполнены мелкими каплями жира; сильная степень — сосуды большинства почечных клубочков и междольчатые артерии содержат крупные капли жира.

 

В последнее время были высказаны сомнения о достоверной практической оценке степени выраженности жировой эмболии, так как классификация В.И. Адкина была разработана на микроскопах старого образца (на наших рабочих микроскопах уже практически не найдёшь объектив х7), без учёта расширения ткани при приготовлении срезов на замораживающем микротоме.

Экспертами Самарского ОБСМЭ (Разматова Т.Н., Филиппенкова Е.И., Ким С.В.) было доказано, что подсчёт жировых эмболов проводить нужно с последующей оценкой по классификации В.И. Адкина. Нами опытным путём (старый микроскоп, окуляр х7, объектив х8) было определено, что 10 полей зрения при увеличении х56 составляют площадь исследования микропрепаратов около 2 кв. см, что соответствует 2-м стандартным срезам 1 х 1см.

 

Примеры описания микропрепаратов:

 Пример№1.

 

ГОЛОВНОЙ МОЗГ (1объект, кора-подкорковая область, судан-3) — на площади срезов 2 кв. см обнаружено 6-7 жировых эмболов в виде оранжево-жёлтых колбасовидных (червеобразных) однородных включений, обтурирующих просветы капилляров, что соответствует слабой степени жировой эмболии большого круга кровообращения по классификации Адкина В.И..

 

ПОЧКА (1объект, судан3) — на площади срезов 2 кв. см единичные капиллярные петли клубочков с наличием обтурирующих мелких жировых эмболов (4-5 штук), что соответствует слабой степени жировой эмболии большого круга кровообращения по классификации Адкина В.И..

 

Пример№2.

 

ЛЁГКИЕ (2объекта, судан-3) — на площади срезов 2 кв.см обнаружено до 20-25 жировых эмболов в виде однородных оранжево-жёлтых капель размерами более 8 мкм, обтурирующих преимущественно просветы капилляров межальвеолярных перегородок, что соответствует слабой степени жировой эмболии малого круга кровообращения по классификации Адкина В.И.. В ряде капилляров мелкие жировые капли оранжево-жёлтого цвета, размерами менее 8 мкм (явление жирового эмболизма).

 

Пример№3.

ЛЁГКИЕ (2объекта, судан-3) — на площади срезов 2 кв.см обнаружено до 40-45 и 50-60 жировых эмболов в виде однородных оранжево-жёлтых капель размерами более 8 мкм, обтурирующих просветы капилляров межальвеолярных перегородок, мелких артерий и вен, что соответствует умеренно выраженной степени жировой эмболии малого круга кровообращения по классификации Адкина В.И.. В ряде капилляров мелкие жировые капли оранжево-жёлтого цвета, размерами менее 8 мкм (явление жирового эмболизма).

 

При микроскопии лёгких обнаружено наличие внутриальвеолярного отёка (1), сладжей эритроцитов, фибриновых и гиалиновых микротромбов (1), наличие жировых эмболов (1), внутрисосудистого лейкоцитоза (1), отсутствие мегакариоцитоза (0), наличие активной миграции макрофагов в просветы альвеол (1).

Цифровой набор: 111101.

Числовое значение КТШ по таблице Вазиной И.Р. 0,98, что подтверждает наличие шоковой реакции, шока.

 

Пример№4.

ЛЁГКИЕ (2объекта, судан-3) — на площади срезов 2 кв.см обнаружено до 210-220 жировых эмболов в виде однородных оранжево-жёлтых капель размерами более 8 мкм, обтурирующих обилие просветов капилляров межальвеолярных перегородок, артерий и вен, что соответствует очень сильной степени жировой эмболии малого круга кровообращения по классификации Адкина В.И.. В большинстве капилляров мелкие жировые капли оранжево-жёлтого цвета, размерами менее 8 мкм (выраженное явление жирового эмболизма).

Администратор