Окраска по Ван — Гизону

Окрашивание соединительной и мышечной тканей

по методу Ван Гизона.

 

Окраска соединительной и мышечной тканей гематоксилин-пикрофуксином по методу Ван — Гизона широко используется в гистологической практике как для получения обзорных препаратов, так и для некоторых специальных целей. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с окраской гематоксилин-эозином, так как по-разному окрашивает различные ткани. Так, соединительная ткань после окраски пикрофуксином имеет ярко-красный цвет, а все остальные ткани — буровато-желтый или желто-зеленый. Метод Ван-Гизона позволяет отдифференцировать гладкомышечные клетки от соединительнотканных в тех случаях, когда их трудно различить на препаратах, окрашенных другими методами. В качестве ядерной окраски применяется железный гематоксилин Вейгерта, дающий черную или буро-черную окраску ядер.

Гематоксилин Вейгерта (О.В.Волкова, Ю.К.Елецкий, 1982) готовят непосредственно перед окрашиванием, смешивая равные объемы основных растворов Вейгерта (первого и второго), которые хранят отдельно.

Первый раствор Вейгерта: в 100 мл 96% спирта растворяют 1г гематоксилина; второй раствор: 4 мл 29% раствора хлорида железа (3 +, или 2-3% раствора железоаммониевых квасцов) сливают с 1мл крепкой хлористоводородной кислоты и добавляют 95 мл дистиллированной воды.

При смешивании растворов приливают второй раствор к первому не в равном, а в несколько меньшем количестве, а затем добавляют второй раствор к полученной смеси по каплям из пипетки до равного количества с первым раствором.

В силу изменения поверхностного натяжения раствора он начинает подниматься по стенкам сосуда (бюкса) и собирается в капли, которые вновь стекают в жидкость. Такое явление указывает на правильное количественное соотношение первого и второго растворов Вейгерта в смеси, и тогда добавление второго раствора надо прекратить. Краситель, если он правильно приготовлен, темно-фиолетового цвета. Если он бурого цвета, то имеется избыток второго раствора. Ядра таким красителем будут окрашиваться не в черный, а в бурый цвет.

Растворы Вейгерта в отдельности можно хранить годами, их смесь — не больше 3-4дней, поэтому лучше всего пользоваться свежим раствором.

Раствор пикрофуксина: к 100мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты прибавляют 5-10 мл 1% водного раствора кислого фуксина.

Если нужно срочно приготовить очень небольшое количество раствора, то в пузырек из-под пенициллина наливают профильтрованный насыщенный раствор пикриновой кислоты (половину пузырька) и к нему по каплям прибавляют 1% раствор кислого фуксина. При этом контролем может служить капля смеси на фильтровальной бумаге, которая должна иметь цвет свежей крови.

 

Окрашивание (О.В.Волкова, Ю.К.Елецкий, 1982):

1. Из дистиллированной воды срезы перенести в гематоксилин Вейгерта на 2-5 мин. Окраску ядер надо контролировать под микроскопом.

2.  Ополоснуть срезы в дистиллированной воде и перенести в водопроводную воду на 10 мин (воду нужно сменить).

3. Поместить срезы на 1-2-3 мин (иногда на 1/2 мин) в пикрофуксин.

4. Быстро (5-10 с) сполоснуть срезы в дистиллированной воде, провести их очень быстро через 96% спирт (можно сменить), просветлить в карбол-толуоле, толуоле и заключить в канадский бальзам.

Результат: коллагеновые волокна ярко-красного цвета, а мышечные и эластические — буровато-желтого или желто-зеленого. Ядра буро-коричневого или буро-черного цвета.

Особенности окраски (О.В.Волкова, Ю.К.Елецкий, 1982). Необходим постоянный контроль под микроскопом. Если ядра приобретают бурый, а не черный цвет, то следует дольше подержать срезы в гематоксилине или меньше в пикрофуксине, так как пикрофуксин обладает сильно дифференцирующим действием в отношении гематоксилина.

Существенным недостатком этого метода является выцветание препаратов, поэтому их нельзя хранить длительное время. Можно использовать гематоксилин Майера, Караци, Эрлиха, но гематоксилин Вейгерта дает лучшую окраску.

Результаты окраски срезов гнилостно изменённого миокарда, а также лёгкого с картиной кандидозной пневмонии по методу ван Гизона.

 

Рис. 1, 2. Цель: с помощью специальной окраски выявить картину возможной ХИБС. Гнилостно изменённый миокард. Слабо выраженное разрастание соединительной ткани в периваскулярных зонах (периваскулярный кардиосклероз) и в межмышечных пространствах (начальный мелкоочаговый интрамуральный кардиосклероз) окрашено в ярко-красный цвет, окружающий миокард — буровато-жёлтый.

Окраска: по Ван-Гизону. Увеличение х250.

Рис. 3, 4. Периваскулярный кардиосклероз ярко-красного цвета на буровато-жёлтом фоне. Окраска: по Ван-Гизону. Увеличение х250.

Рис. 5-14. Гнилостно изменённый миокард. Сетчатый интрамуральный кардиосклероз различной степени выраженности (окрашен в ярко-красный цвет на буровато-жёлтом фоне). Окраска: по Ван-Гизону. Увеличение х250.

 

 

Рис. 15, 16. Грибковая (кандидозная) пневмония. Древовидное разрастание псевдомицелия. В просветах ряда альвеол сетчатые массы рыхло расположенного фибрина. Препарат представлен кафедрой судебной медицины Ижевской ГМА.

Окраска: по Ван-Гизону. Увеличение х250.

 

Следует заметить, что в общем методика эта капризна и непостоянна. Из ряда моментов, определяющих успех или неуспех реакции, главным следует считать качество красителя: только при применении красителя высокого качества можно ожидать четкой и красивой реакции. Большое значение имеет также качество дистиллированной воды.Иногда во время споласкивания срезов в дистиллированной воде цвет окраски изменяется. В таком случае необходимо заменить воду. Вообще следует работать по возможности с дважды дистиллированной водой.

Надо учитывать (по А.Б.Шехтеру), что интенсивность окраски коллагеновых волокон зависит от плотности соединительной ткани и зрелости волокон. В зрелых волокнах плотность расположения молекул коллагена в протофибриллах и фибриллах, а фибрилл в самих волокнах выше, чем в незрелых. Вследствие этого создаётся более высокая концентрация химических групп белка, обеспечивающих связь с красителем, и уменьшается его диффузия. Незрелые волокна, богатые содержащим углевод цементирующим веществом, не окрашиваются. Беспорядочное расположение фибрилл и содержание большого количества протеогликанов также способствует снижению интенсивности окрашивания (например, хрящевая ткань). Денатурация коллагена, ведущая к разворачиванию спиральной структуры молекулы, как в желатине, также ослабляет окраску. В связи с этим, участки соединительной ткани, где отмечается фибриноидная или другая дезорганизация, имеют слабую окраску.

Администратор